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Biologia das Comunicações volume 6, Número do artigo: 277 (2023) Citar este artigo

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Expandir o arsenal de abordagens profiláticas contra SARS-CoV-2 é de extrema importância, especificamente aquelas estratégias que são resistentes à deriva antigênica em Spike. Aqui, realizamos uma triagem de mais de 16.000 gatilhos de RNAi contra o genoma SARS-CoV-2, usando um ensaio massivamente paralelo para identificar siRNAs hiperpotentes. Selecionamos dez candidatos para validação in vitro e encontramos cinco siRNAs que exibiram atividade hiperpotente (IC50 < 20 pM) e forte bloqueio de infecciosidade em experimentos com vírus vivos. Nós aprimoramos ainda mais essa atividade por pareamento combinatório dos candidatos a siRNA e identificamos coquetéis que eram ativos contra vários tipos de variantes preocupantes (VOC). Em seguida, examinamos mais de 2.000 mutações possíveis nos locais-alvo do siRNA usando mutagênese de saturação e confirmamos a ampla proteção do coquetel principal contra variantes futuras. Finalmente, demonstramos que a administração intranasal deste coquetel de siRNA efetivamente atenua os sinais clínicos e as medidas virais da doença no modelo de hamster sírio padrão-ouro. Nossos resultados abrem caminho para o desenvolvimento de uma camada adicional de profilaxia antiviral ortogonal às vacinas e aos anticorpos monoclonais.

A Covid-19 tem sido uma das piores pandemias do mundo nos tempos modernos. Embora as vacinas tenham sido um grande triunfo, há uma necessidade urgente de expandir o arsenal de medidas preventivas para abordar algumas de suas deficiências1. Primeiro, praticamente todas as vacinas licenciadas têm como alvo a proteína Spike2,3, convergindo para um único ponto de falha, dada a exposição a mutantes de escape e variantes virulentas emergentes4,5,6,7,8. Além disso, como todos os tratamentos com anticorpos monoclonais (mAb) visam essa mesma proteína, essas mudanças antigênicas não apenas dificultam a proteção das vacinas, mas também podem reduzir a eficácia de uma ampla gama de outros tipos de tratamento. Em segundo lugar, vários estudos mostraram que a proteção das vacinas, inclusive contra doenças graves, geralmente diminui em apenas alguns meses, após a segunda9, terceira10,11 ou quarta dose12. Terceiro, linhas recentes de evidências derivadas de camundongos e primatas não humanos (NHPs) sugerem que versões atualizadas de vacinas exibem eficácia reduzida e podem estar sujeitas ao pecado antigênico original13,14, quando a primeira exposição a um vírus molda o resultado de exposições subsequentes cepas relacionadas antigenicamente. Esses dados sugerem a utilidade limitada das atualizações de vacinas para variantes emergentes preocupantes (VoCs). Quarto, medicamentos antivirais como o Paxlovid falharam em proteger os adultos da exposição ao COVID-19. Finalmente, vários estudos mostram consistentemente que é desafiador alcançar alta proteção em indivíduos imunocomprometidos, mesmo após doses repetidas15, o que implica que os indivíduos que mais precisam de uma vacina são os menos prováveis de se beneficiar dela. Por fim, infecções em indivíduos imunocomprometidos podem ter duração prolongada16,17, o que aumenta o risco de hiperevolução e surgimento de VoCs, impondo grandes riscos à saúde pública.

Apoiados pelo sucesso de vários estudos anteriores em que pequenos RNAs interferentes (siRNAs) foram efetivamente usados como antivirais18,19,20,21, imaginamos que os siRNAs administrados por via intranasal (in) seriam particularmente adequados como uma medida de reforço vacinal para infecções de o trato respiratório superior, onde podem ser usados para mitigar a transmissão.

Para esse fim, examinamos mais de 16.000 gatilhos de interferência de RNA (RNAi) direcionados ao genoma SARS-CoV-2 para identificar candidatos hiperpotentes. A triagem contou com um ensaio massivamente paralelo, Sens.AI, que emprega um sistema de biologia sintética para recapitular a atividade de silenciamento de cada candidato a siRNA contra o vírus. Em nossos estudos anteriores22,23, usamos uma versão anterior do Sens.AI para identificar siRNAs hiperpotentes contra HIV e HCV. No entanto, o projeto anterior era ineficiente, levando mais de 6 meses para ser executado. No novo design, inventamos um método mais rápido que aprimora a relação sinal-ruído empregando aprendizado estatístico em vez de etapas experimentais laboriosas. Extensas análises computacionais e experimentos in vitro produziram um coquetel de dois candidatos a siRNA hiperpotentes, que se mostraram eficazes contra todas as cepas virais testadas. Finalmente. a administração intranasal deste coquetel de siRNA foi confirmada como eficaz no modelo de hamster sírio de SARS-CoV-2.

1.4uM). Overall, these results show that our novel genome-wide screening method identifies hyper-potent siRNAs within a single cycle./p>95%. Interestingly, both S8 and S10 showed weak responses, at the level of ~10% SARS-CoV-2 inhibition compared to the control siRNA, despite very high potency in the reporter assay (IC50 < 20 pM). However, unlike the other siRNA candidates, these two target the virus's negative strand, which is an intermediary in the replication process. Therefore, we hypothesised that targeting this intermediary RNA molecule likely would not interfere with viral replication. To further confirm our top candidates, we assessed the effect on live virus infectivity in cells using TCID50 assay (Fig. 3b). Again, we found a strong inhibitory activity of the top three out of four siRNAs, with viral repression exhibiting approximately two orders of magnitude compared to the GFP siRNA control. We next used the same settings to test five of the most potent siRNAs from the open-source discovery method (Supplementary Table 3). Only one candidate, Hel14, displayed repression levels of the viral load by >95%, on par with the levels exhibited by the top siRNAs from our Sens.AI screen (~90% inhibition) (Fig. 3c)./p>95% repression) (Fig. 3f). Interestingly, S5 was tolerant and showed efficacy against the Delta strain despite the fact that it possesses a mutation in position 14 of its target site. Second, we tested the S5/Hel14 cocktail against Omicron BA.1 using a similar setting. Similar to other reports33, the Omicron variant did not replicate as fast as other VoCs in vitro. Since these lower replication rates reduced the dynamic range of our assays, we added two positive controls, chloroquine and molnupiravir, both of which demonstrated as potent inhibitors of Omicron BA.1. The activity of the S5/Hel14 cocktail was indeed diminished in the Omicron variant. Nevertheless, it inhibited viral replication to a similar level as was induced by the positive control treatments (Fig. 3g). This finding suggested that the more modest inhibition was likely the result of a lower dynamic range due to slow viral replication, rather than due to reduced potency of the RNAi cocktail itself. Finally, we tested the activity of the cocktails against our novel replicon system, which recapitulated the function, but not infectivity of the Beta SARS-CoV-2 strain34. Consistently, the cocktails repressed the replicon by 10-15 fold, indicating that they confer a robust inhibition profile across diverse VoCs34. Importantly, analysis of high throughput sequencing data showed that cells that were treated with the S3/S5 cocktail exhibited a specific profile of depletion of reads at the siRNA cleavage sites (Fig. 3h). These data provide mechanistic support to confirm that the observed reduction in viral load was directly related to siRNA silencing./p>51% reduction in this score. Based on previous studies, the former mutation type is seven times more common than the latter36, suggesting that S5 could tolerate to some extent the more prevalent type of double mutations in the target site./p>7% weight loss at Day 5 postinfection, consistent with previous studies38,39,40. The siRNA-treated group benefited from significant protection against weight loss compared to this negative control group (p < 0.05; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5b). This weight loss was statistically indistinguishable from the positive control group that was treated with bamlanivimab. In addition, we observed an order of magnitude suppression of viral load in the lungs of the active treatment group (Day 5) compared to the negative control, as measured by qPCR measurement of the RdRP gene (ΔVLlung = 10.3x, plung < 0.001; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5c). Similarly, we also observed a significant suppression, albeit to a lesser extent, of viral load in the nares (ΔVLlung = 2.5x, plung < 0.05; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5d). In both cases, the antibody was more effective than the siRNA treatment, suggesting that additional dose optimization studies are required in order to fully develop the siRNA cocktail into a viable prophylactic./p>