Base estrutural dos modos de ligação do ligante de EAAT2 humano

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 3329 (2022) Citar este artigo

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No sistema nervoso central (SNC), os transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs) medeiam a captação do neurotransmissor excitatório glutamato e mantêm suas baixas concentrações na fenda sináptica para evitar a citotoxicidade neuronal. A disfunção dos EAATs pode levar a muitas doenças psiquiátricas. Aqui relatamos estruturas crio-EM de EAAT2 humano em uma conformação voltada para dentro, na presença do substrato glutamato ou do inibidor seletivo WAY-213613. O glutamato é coordenado por extensas pontes de hidrogênio e posteriormente estabilizado por HP2. O inibidor WAY-213613 ocupa uma bolsa de ligação semelhante à do substrato glutamato. Após a associação com o WAY-213613, o HP2 sofre uma alteração conformacional substancial e, por sua vez, estabiliza a ligação do inibidor formando interações hidrofóbicas. Experimentos eletrofisiológicos elucidam que o único S441 desempenha papéis fundamentais na ligação de hEAAT2 com glutamato ou WAY-213613, e o cluster I464-L467-V468 atua como um determinante estrutural chave para a inibição seletiva deste transportador por WAY-213613.

O glutamato é o neurotransmissor excitatório predominante, que desempenha um papel fundamental no desenvolvimento do sistema nervoso central dos mamíferos e participa da função cerebral normal, como incorporação de aprendizado, cognição e memória1. Além disso, o excesso de glutamato pode levar à excitotoxicidade, que pode matar as células neuronais por meio da estimulação excessiva dos receptores de glutamato2. Assim, é fundamental manter baixas concentrações de glutamato nos líquidos extracelulares. Os EAATs são conhecidos como transportadores de aminoácidos excitatórios, incluindo cinco subtipos (EAAT1–EAAT5), que são responsáveis ​​pela remoção do glutamato da fenda sináptica ligando-se rapidamente e transportando os glutamatos de volta para a pré-sinapse ou astrócitos, o que contribui para a terminação da atividade sináptica e à depuração do glutamato extracelular potencialmente citotóxico3. Entre os cinco EAATs, o EAAT2 humano (hEAAT2) é predominantemente expresso em astrócitos e foi relatado como sendo responsável por 90-95% da captação de glutamato no prosencéfalo por um mecanismo elevador3,4. Portanto, o hEAAT2 pode manter o glutamato extracelular em níveis baixos na fenda sináptica, que é um dos EAATs mais importantes para proteger os neurônios5,6. A deficiência de hEAAT2 causa morte neuronal progressiva e doenças psiquiátricas ou neurológicas, incluindo transtorno depressivo maior, epilepsia, doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral, doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica (ELA) e, portanto, hEAAT2 representa um potencial alvo terapêutico6,7,8.

Os EAATs são estruturalmente semelhantes ao homólogo archaeal GltPh, todos os quais são homotrímeros compostos por três protômeros idênticos9,10. O protômero individual tem oito hélices transmembrana (TM 1–8) e duas alças em gancho (HP) organizadas em dois domínios: o domínio scaffold compreende TM1, 2, 4 e 5, que é responsável por estabilizar o domínio de transporte; o domínio de transporte inclui TM 3, 6, 7 e 8, HP1 e HP2. Estudos anteriores mostraram que a subunidade individual em EAATs pode transportar o substrato independentemente11,12,13, e o sítio de ligação ao substrato é constituído pela região central desenrolada de TM7 (motivo NMDGT), TM8 e pontas de HP1 e HP23,9.

As estruturas dos homólogos arqueais (GltPh4,9,10,14,15,GltTk16,17,18) e quatro transportadores SLC1 humanos (hEAAT119, hEAAT320, hASCT121 e hASCT222,23,24,25) foram resolvidas e compartilham conservação de alta sequência no bolso de ligação do ligante, incluindo TM7, TM8, HP1 e HP2. No entanto, ainda é desejável determinar a estrutura de hEAAT2, uma vez que compartilha identidades de sequência baixas com esses homólogos (34% de identidade de sequência com GltPh e GltTk, 50% de identidade de sequência com hEAAT1 e hEAAT3, 42% e 39% de identidade de sequência com hASCT1 e hASCT2, respectivamente). WAY-213613 é um inibidor potente e altamente seletivo para hEAAT2 (IC50 é 85 nM), que tem afinidade de 59 vezes e 44 vezes sobre os de hEAAT1 e hEAAT3 (IC50 é 5 e 3,8 μM, respectivamente)26. No entanto, o mecanismo que WAY-213613 inibe altamente seletivamente o transporte de glutamato por hEAAT2 permanece indefinido.