Emulsões duplas como alta

ISME Communications volume 3, Número do artigo: 47 (2023) Citar este artigo

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Nossa compreensão da fisiologia microbiana in situ é baseada principalmente na caracterização fisiológica de micróbios de crescimento rápido e facilmente isoláveis. Os enriquecimentos microbianos para obter novos isolados com taxas de crescimento mais lentas ou fisiologias adaptadas a ambientes com poucos nutrientes são afetados por vieses intrínsecos para espécies de crescimento mais rápido ao usar protocolos de isolamento de laboratório padrão. São necessárias novas ferramentas de cultivo para minimizar esses vieses e enriquecer taxa menos bem estudadas. Neste estudo, desenvolvemos uma plataforma de enriquecimento bacteriano de alto rendimento baseada no encapsulamento de célula única e crescimento em emulsões duplas (GrowMiDE). Mostramos que o GrowMiDE pode cultivar muitos microrganismos diferentes e enriquecer para táxons sub-representados que nunca são observados em enriquecimentos tradicionais em batelada. Por exemplo, impedir o domínio do enriquecimento por micróbios de crescimento rápido devido à privatização de nutrientes dentro das gotículas de emulsão dupla permitiu o cultivo de Negativicutes e Metanobactérias de crescimento mais lento a partir de amostras de fezes em culturas de enriquecimento de meio rico. Em experimentos de competição entre cepas especializadas em taxa de crescimento e produção de crescimento, os enriquecimentos GrowMiDE impediram a competição por pools de nutrientes compartilhados e enriquecidos para cepas de crescimento mais lento, mas mais eficientes. Finalmente, demonstramos a compatibilidade do GrowMiDE com a triagem de células ativadas por fluorescência comercial (FACS) para obter isolados de enriquecimentos de GrowMiDE. Juntos, GrowMiDE + DE-FACS é uma nova e promissora plataforma de enriquecimento de alto rendimento que pode ser facilmente aplicada a diversos enriquecimentos ou telas microbianas.

Nossa compreensão da fisiologia microbiana é amplamente baseada em estudos usando micróbios isolados em culturas puras. As técnicas para isolar novos micróbios nos últimos 140 anos envolvem a recriação de um ambiente favorável e um fluxo de nutrientes em laboratório que imita as condições naturais e, em seguida, a tentativa de recuperar as novas espécies cultivadas. Como resultado, os métodos atuais são inerentemente tendenciosos para micróbios de crescimento rápido que podem competir com outras espécies por nutrientes compartilhados, mesmo espécies com pequenas diferenças na taxa máxima de crescimento (µMax) (Fig. S1–S3) [1, 2]. As espécies desaparecidas de crescimento mais lento podem ter estratégias fisiológicas desconhecidas para se adaptar ao seu ambiente natural e que provavelmente desempenham papéis críticos na resiliência da comunidade [3]. Por exemplo, a eficiência de crescimento (rendimento de crescimento) sobre as taxas de crescimento tem sido sugerida como uma estratégia de sobrevivência em baixo fluxo de nutrientes ou ambientes espacialmente estruturados, incluindo biofilmes [1, 2, 4] e o ambiente subsuperficial marinho (~ 30% da biomassa da Terra). [5,6,7,8]. Um desafio adicional não trivial é criar um ambiente químico adequado que suporte o crescimento de diferentes estilos de vida microbianos (por exemplo, oligotróficos ou copiotróficos). Portanto, há uma necessidade crítica de desenvolver novas ferramentas de cultivo que minimizem a tendência para taxas rápidas de crescimento microbiano.

Os métodos tradicionais que limitam a competição por recursos finitos (ou seja, pela privatização de nutrientes) geralmente dependem da separação espacial e incluem diluição até a extinção ou semeadura para unidades formadoras de colônias [9, 10]. No entanto, essas técnicas dependem da abundância de células, são de baixo rendimento e não são propícias à recuperação de micróbios que crescem mal nas interfaces ar-líquido, especialmente anaeróbios [11, 12]. As abordagens microfluídicas de gotículas surgiram como uma técnica poderosa de alto rendimento para cultivar novos microrganismos em biorreatores isolados, cada um com distribuições precisas de reagentes necessários para o crescimento [10, 13,14,15,16], facilitando telas para resistência a antibióticos [13, 17, 18], e medições da atividade celular [19,20,21]. A maioria das abordagens microbiológicas de gotículas usa gotículas de emulsão única, nas quais gotículas aquosas contendo células e meio são suspensas em uma fase oleosa. Muitos estudos mostraram a utilidade da microfluídica de gotículas de emulsão única para o levantamento da diversidade microbiana [21,22,23,24], obtenção de genomas de alta qualidade [25] e telas funcionais [10, 13, 16, 18]. As técnicas de enriquecimento de emulsão única também demonstraram a seleção de cepas com rendimentos de crescimento elevados ou taxas de crescimento mais lentas, servindo como prova de conceito para o impacto da privatização de nutrientes nos resultados do enriquecimento [26]. No entanto, gotículas de emulsão única requerem equipamento personalizado para analisar a jusante e só foram classificadas em demonstrações de prova de conceito com velocidades de classificação lentas e canais de fluorescência limitados [27, 28], tornando-as difíceis de aplicar a novos sistemas.