Fígado RBFOX2 regula a homeostase do colesterol via splicing alternativo Scarb1 em camundongos

Nature Metabolism volume 4, páginas 1812–1829 (2022)Cite este artigo

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O splicing alternativo de RNA (AS) expande o potencial regulatório dos genomas eucarióticos. Os mecanismos que regulam os perfis AS específicos do fígado e sua contribuição para a função hepática são pouco compreendidos. Aqui, identificamos um papel fundamental para a proteína Fox de ligação ao RNA do fator de splicing 2 (RBFOX2) na manutenção da homeostase do colesterol em um ambiente lipogênico no fígado. Usando reticulação ultravioleta de resolução de nucleotídeo individual aprimorada e imunoprecipitação, identificamos alvos fisiologicamente relevantes de RBFOX2 no fígado de camundongos, incluindo o receptor scavenger classe B tipo I (Scarb1). A função de RBFOX2 está diminuída no fígado na obesidade induzida por dieta, causando uma troca da isoforma Scarb1 e alteração da homeostase lipídica dos hepatócitos. Nossos achados demonstram que programas específicos de EA mantêm ativamente a fisiologia hepática e fundamentam os efeitos lipotóxicos de dietas obesogênicas quando desreguladas. Os oligonucleotídeos de comutação de emenda direcionados a essa rede aliviam a inflamação induzida pela obesidade no fígado e promovem um perfil de lipoproteína antiaterogênica no sangue, ressaltando o potencial da terapêutica de RNA específica de isoforma para o tratamento de doenças associadas ao metabolismo.

Em mamíferos, a maioria dos genes multi-exon sofre AS, gerando múltiplas isoformas1,2 e contribuindo para a complexidade da transcrição3. Acredita-se que o AS seja crítico para o estabelecimento e manutenção de redes de interação de proteínas tecido-específicas4,5,6 e identidade de tecido6. Se programas específicos de AS regulam a adaptação fisiológica é menos bem compreendido, e seu papel na doença metabólica não é claro, devido à má caracterização funcional de isoformas específicas e aos desafios técnicos envolvidos na identificação de fatores de splicing regulatórios upstream específicos in vivo. Assim, há informações limitadas sobre as redes de splicing envolvidas na reprogramação metabólica, tanto no nível dos fatores de splicing quanto das isoformas que eles regulam. Além de aumentar nosso conhecimento da regulação metabólica na saúde e na doença, a caracterização de fatores de splicing e isoformas envolvidas na regulação metabólica pode levar ao desenvolvimento de terapias baseadas em RNA para modular isoformas específicas. Terapêuticas baseadas em RNA para inativar genes específicos no fígado estão surgindo como estratégias terapêuticas promissoras para patologias metabólicas7,8. No entanto, a terapêutica de RNA de comutação de splicing ainda não foi explorada.

Paralelamente ao aumento global da obesidade, a doença hepática gordurosa associada ao metabolismo (MAFLD) tornou-se a patologia hepática não transmissível mais prevalente9. A MAFLD varia desde a esteatose hepática pré-sintomática (fígado gorduroso) até a esteato-hepatite não alcoólica, que se caracteriza por inflamação, lesão hepatocelular e fibrose, podendo evoluir para insuficiência hepática, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC)10.

Embora os mecanismos exatos que promovem a progressão da esteatose para a esteatohepatite não alcoólica não sejam totalmente compreendidos, as evidências sugerem que a supernutrição crônica e as dietas hipercalóricas de estilo ocidental contribuem para a desregulação de espécies lipídicas bioativas e/ou tóxicas, como fosfolipídios, ácidos graxos saturados , esfingomielinas, ceramidas e colesterol11,12,13. Além disso, há evidências de que a MAFLD contribui para a patogênese do diabetes tipo 2 e da doença cardiovascular, sendo a doença arterial coronariana a principal causa de morte nesses pacientes14,15. Compreender como a MAFLD está ligada ao aumento do risco cardiovascular e ao dano hepático progressivo ajudará na identificação de novos alvos terapêuticos.

Aqui, descobrimos que os componentes da maquinaria pré-mRNA AS são regulados seletivamente por entradas metabólicas no fígado. Identificamos o homólogo 2 do RNA-binding fox-1 (RBFOX2) como um fator de splicing chave no fígado, regulando o AS em um grupo de genes envolvidos na homeostase lipídica, incluindo receptor scavenger classe B tipo I (Scarb1), fosfolipase A2 grupo VI ( Pla2g6), o adaptador de vesícula de clatrina Numb, um componente do sistema de tráfego de vesículas COPII Sec31a e proteína de ligação de oxisterol 9 (Osbpl9). Nós revelamos que RBFOX2 regula AS em resposta a dietas obesogênicas, e que a rede AS regulada por RBFOX2 pode ser direcionada terapeuticamente. Os oligonucleotídeos de troca de emenda (SSOs) modulando o splicing de Scarb1 revertem o acúmulo de espécies lipotóxicas em hepatócitos de camundongos deficientes em RBFOX2, aliviam a inflamação hepática associada à obesidade induzida por dieta in vivo e promovem um perfil de lipoproteína anti-aterogênica no sangue, demonstrando o potencial de Terapêutica de RNA específica de isoforma para patologias metabólicas.

TTACTGACCGTACACCAAATTTGCCTGC and CreR1>CCTGGCAGCGATCGCTATTTTCCATGAGTG, Rbfox2F1> AACAAGAAAGGCCTCACTTCAG and Rbfox2R1>GGTGTTCTCTGACTTATACATGCAC. All in vivo work was approved by the animal welfare and ethical review board at Imperial College London and in accordance with the United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986)./p>

100 and an isolation specificity >0.7 were used for quantification. Each TMT was normalized to the total signal in each column. To allow the comparison of both TMT, those proteins quantified in both TMT, data were normalized using the bridge channels present in each TMT. Quantifications included in Supplementary Table 1 are represented as relative abundances. Newly generated proteomic datasets are publicly available as described below./p> 8, was performed and libraries were prepared using the NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina and multiplexed using NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB, E7760S and E7335S). Sequencing was carried out with 100 basepair paired end reads with HiSeq 2500 (Illumina). Newly generated RNA-seq datasets are publicly available as described below. Previously published datasets of mice fed a HFr diet were obtained from GSE123896 (ref. 16). Data were processed using RTA v.1.18.54, with default filter and quality settings. The reads were demultiplexed with CASAVA v.2.17. Reads were aligned to Ensembl mouse genome (GRCm38) using Tophat2 (v.2.0.11)61 with the argument ‘–library-type fr-firststrand’. Reference sequence assembly and transcript annotation were obtained from Illumina iGenomes (https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html). Gene-based read counts were obtained using featureCounts function from Rsubread Bioconductor package62. Normalization and differential expression analysis were performed using DEseq2 (ref. 63) or edgeR-voom-limma64,65,66,67 bioconductor packages. AS was primarily analysed with rMATs68. Differentially spliced sites were kept for data visualization if they passed the following threshold: P < 0.05; FDR < 0.1 and absolute(IncLevelDifference) >0.1 or <-0.1. Gene ontology analysis was carried out by using GOseq Bioconductor package69. A list of differentially expressed genes with adjusted P value of less than or equal to 0.05 were selected as input for the ingenuity pathway analysis (http://www.ingenuity.com/index.html). No cut-off was applied for fold change of differential expression. Enrichment of binding motifs for different splicing factors were tested using the binomTest function from the edgeR bioconductor package70./p>$OUTPUT.adapterTrim.fastq 2 > $OUTPUT.adapterTrim.metrics’./p>

0.2/p>